A pregabalin nem GABAA vagy GABAB receptor agonista.
A pregabalin gabapentinoid, és bizonyos kalciumcsatornák gátlásával fejti ki hatását.Pontosabban, bizonyos feszültségfüggő kalciumcsatornák (VDCC-k) α2δ segédalegység-helyének liganduma, és ezáltal az α2δ alegységet tartalmazó VDCC-k inhibitoraként működik.Két gyógyszerkötő α2δ alegység létezik, az α2δ-1 és α2δ-2, és a pregabalin hasonló affinitást mutat (és ebből következően a szelektivitás hiánya) e két helyhez.A pregabalin szelektíven kötődik az α2δ VDCC alegységhez.Annak ellenére, hogy a pregabalin GABA analóg, nem kötődik a GABA receptorokhoz, nem alakul át GABA-vá vagy más GABA receptor agonistává in vivo, és nem modulálja közvetlenül a GABA transzportot vagy metabolizmust.Mindazonáltal a pregabalinról azt találták, hogy dózisfüggő növekedést idéz elő az L-glutaminsav-dekarboxiláz (GAD) agyi expressziójában, a GABA szintéziséért felelős enzimben, és ezért közvetett GABAerg hatást fejthet ki a GABA szintjének növelésével az agyban.Jelenleg nincs bizonyíték arra, hogy a pregabalin hatásait az α2δ-tartalmú VDCC-k gátlásán kívül más mechanizmus közvetíti.Ennek megfelelően úgy tűnik, hogy az α2δ-1-tartalmú VDCC-k pregabalin általi gátlása felelős annak görcsoldó, fájdalomcsillapító és szorongásoldó hatásáért.
Az endogén α-aminosavak, az L-leucin és L-izoleucin, amelyek kémiai szerkezetükben nagyon hasonlítanak a pregabalinra és a többi gabapentinoidra, az α2δ VDCC alegység látszólagos ligandumai, hasonló affinitással, mint a gabapentinoidok (pl. IC50 = 71 nM az L-re). izoleucin), és mikromoláris koncentrációban vannak jelen az emberi agy-gerincvelői folyadékban (pl. 12,9 μM L-leucin, 4,8 μM L-izoleucin).Az elmélet szerint ezek az alegység endogén ligandumai lehetnek, és kompetitív módon antagonizálhatják a gabapentinoidok hatásait.Ezzel összhangban, míg a gabapentinoidok, például a pregabalin és a gabapentin nanomoláris affinitást mutatnak az α2δ alegységhez, in vivo erejük az alacsony mikromoláris tartományba esik, és az endogén L-aminosavak kötődéséért folytatott versengés valószínűleg felelős ezért az eltérésért.

Egy vizsgálatban azt találták, hogy a pregabalin hatszor nagyobb affinitással rendelkezik az α2δ alegységet tartalmazó VDCC-k iránt, mint a gabapentin.Egy másik tanulmány azonban azt találta, hogy a pregabalin és a gabapentin hasonló affinitással rendelkezik a humán rekombináns α2δ-1 alegységhez (Ki = 32 nM, illetve 40 nM).Mindenesetre a pregabalin fájdalomcsillapítóként 2-4-szer erősebb, mint a gabapentin, állatokban pedig 3-10-szer erősebb görcsoldóként, mint a gabapentin.